摘要：本文进行罗非鱼对黄曲霉毒素B1（AFB1）的慢性中毒反应的研究，有助于评估罗非鱼暴露于AFB1下的安全性。本实验以含AFB1的配合饲料长期饲喂罗非鱼（初始鱼重约20g），研究罗非鱼机体受损的变化以及组织中的AFB1残留情况。饲料中AFB1含量分别为：19（对照组），85，，，或μgAFB1/kg饲料，实验为期20周。研究表明，膳食性AFB1会引起罗非鱼的黄曲霉毒素中毒症，且病症严重程度与剂量、暴露时间呈正相关关系；但各组均未出现大量死亡。
与对照组相比，饲料中含有或超过μgAFB1/kg时会影响罗非鱼的生长；当饲料中AFB1含量≥μg/kg时，罗非鱼呈现慢性病症（肝体比显著下降，肝脏P的EROD活力明显受抑制，肝脏中炎症细胞浸润、嗜酸性物质增多和空泡化坏死严重）。在15周和20周的肝脏样品中，AFB1残留量与暴露的剂量、时间成正比；然而，直到20周实验结束，罗非鱼肌肉样品的AFB1残留量仍低于检测限（1μg/kg）。所以，饲料受AFB1污染对罗非鱼的生长和机体有一定损害，但肌肉中积累量不高。
1前言
罗非鱼是一种在热带、亚热带地区被广泛养殖的水产品种，这些地区正好是黄曲霉毒素污染比较严重的地区。虽目前已有不少关于黄曲霉毒素对罗非鱼影响的研究，但其作用机理尚不明确，且研究结果有些相互矛盾。El-Banna等（）报道尼罗罗非鱼采食含有μg/kgAFB1的饲料10周后生长性能受到了抑制，而μg/kg组的死亡率高达16.7％。在Cagauan等（4）的研究中，采食含5~38.62μg/kgAFB1的饲料后的罗非鱼的存活率只有对照组的67％，且罗非鱼暴露在AFB1含量超过29μg/kg的饲料时普遍出现了体表变黄的症状。然而，另一些研究者却得到了截然不同的研究结果。Tuan等（2）报道，采食含有或低于μg/kgAFB1的饲料8周后，罗非鱼的生长并没受到任何的影响。同一报道中还指出，在进食含2.5mg/kgAFB1的饲料8周后，罗非鱼的生长和血液成分受到了影响。Chávez-Sánchez等（）甚至认为罗非鱼可耐受量的浓度高达30mgAFB1/kg饲料。
此外，随着受污染的食品或饲料进入动物体内后，AFB1及其代谢物会残留在动物的体内，从而通过食物链对更多的物种产生影响。Bintvihok等（2）报道了鹌鹑喂食3mgAFB1/kg的日粮8天后，其肝脏中残留着高达7.83μg/kg的AFB1，同时在肌肉中也有0.38μgAFB1/kg的残留。其它一些研究报告（El-Sayed等，9）中也指出黄曲霉毒素及其代谢物会在水生动物的机体内有低浓度的残留，这将给食用这些动物组织带来潜在的风险。因而，霉菌毒素污染，尤其是黄曲霉毒素污染，不仅影响着人和动物的健康，也带来巨大的经济损失（Messonnier等，7）。
在鱼粉价格高涨而不得不大量使用植物蛋白源的今天，霉菌毒素污染的问题被进一步放大。因而，不仅要开展对动物的黄曲霉毒素中毒症状的研究，更要研究黄曲霉毒素及其代谢物在动物组织中残留情况。
目前，关于水生动物的AFB1实验大多数停留在AFB1对动物生长性能影响的研究上，对黄曲霉毒素在机体中的残留的研究甚少。因此，本实验以饲喂含AFB1饲料的方式，开展罗非鱼的慢性致毒实验，旨在研究在长期的生长阶段中AFB1对罗非鱼的影响机制，以及AFB1在罗非鱼机体组织中的残留情况，进而评估AFB1污染造成的经济损失和由此带来的安全隐患。
2材料与方法
2.1黄曲霉毒素的制备、实验饲料及动物
在本实验室制备黄曲霉菌（Aspergillusflavus，NRRL）发酵的花生粕。6组饲料分别添加霉变花生粕0%、1%、5%、10%、15%、25%，并以第1组为对照组。各原料和饲料中的AFB1以及其它霉菌毒素（T-2毒素、玉米烯酮、赭曲霉素、烟曲霉毒素、呕吐毒素）含量分别见表1和表2。
从番禺罗非鱼良种场购进0尾罗非鱼幼鱼（Oreochromisniloticus×O.aureus），置于若干个水泥池（3m×2m×1m）中驯养一个月，期间投喂商业饲料。选取体重约为20g的罗非鱼，并将其分成6组，每组3个重复，每个水泥池中各有60尾鱼。实验周期为20周，期间水温为23.93±3.5℃，溶氧为8.17±0.7mg/L，总氨氮含量为0.54±0.1mg/L，pH值为7.43±0.4。
3结果
3.1行为反应和体色变化
在20周的实验中，各组试验罗非鱼行为均无异常。染毒处理4~5周后，高剂量组（μg/kg和μg/kg组）的部分罗非鱼出现黄体现象；但随着罗非鱼性成熟，其体色加深。
3.2生长性能和存活率
在实验的过程中实验各组罗非鱼存活率较高，均在98%以上，并无显著性差异（表3）。由各阶段的增重率（图1）可知，AFB1对罗非鱼生长的抑制作用随AFB1浓度、染毒时间长短呈梯度递增关系。15周后，μg/kg组的增重率显著低于其它各组。20周后，饲料中含、、和μg/kg的各组增重率明显低于对照组和85μg/kg组，且μg/kg组增重率显著低于其它各组。同样，罗非鱼的饲料摄食量呈现下降的趋势，其中最高剂量组（μgAFB1/kg组）显著最低。在饲料效率方面，μg/kg以上的组别饲料效率显著下降，其中，最高剂量组（μgAFB1/kg组）显著差于其它各组。
图1采食不同浓度AFB1的罗非鱼各阶段的增重率
增重率（%）=×（各周终末体重-初始体重）/初始体重。
*和**：指与对照组相比下，差异性水平分别为P0.05和P0.01。
3.3形体指标
如图2A所示，各处理组的肝体比随着饲料中AFB1含量的增加而显著下降。在整个实验过程中，对照组和85μgAFB1/kg组的肝体比总高于其它四组。20周后，对照组的肝体比显著高于其它各组；且、和μg/kg组的肝体比明显低于其余各组，但相互间差异不显著。染毒处理后，罗非鱼的肠体比也随着染毒剂量的增加下降。如图2B，采食含AFB1的饲料10周起至20周，μg/kg组的脂体比显著低于对照组。饲料中的AFB1对罗非鱼的脏体比和肥满度无显著影响（数据未显示）。
图2采食不同浓度AFB周后的罗非鱼的形态学指标
A，肝体比（%）=肝脏重×/体重；
B，肠脂比（%）=肠系膜脂肪重×/体重；
*和**指与对照组相比下，差异性水平分别为P0.05和P0.01。
3.4肌肉、肝脏营养成分分析
20周染毒后，AFB1对罗非鱼肌肉组成无显著性差异，但显著影响了肝脏的化学组成（表4）。随着饲料中AFB1含量的升高，肝脏粗脂肪含量显著下降，而水分和蛋白含量则随之显著上升。当罗非鱼采食含AFB1达μg/kg或更高剂量的饲料20周后，其肝脏脂肪含量则明显低于对照组，且肝脏水分和蛋白含量明显高于对照组。
3.5PEROD活力
图3为经20周染毒处理的罗非鱼的肝细胞色素P的EROD活力。本研究中，所有AFB1添加组的罗非鱼EROD活力显著低于对照组，但各添加组间的EROD活力差异不显著。
图3采食不同浓度AFB周后的罗非鱼肝脏PEROD活力
标有不同字母表示差异显著（P0.05）
3.6组织中的AFB1残留
如表5所示，随饲料中AFB1含量的增加，罗非鱼肝脏中的AFB1残留量也明显增加。15周的染毒实验后，μg/kg或更高剂量组的罗非鱼肝脏中的AFB1残留显著高于对照组；而这种规律一直维持到20周的实验结束。同一实验处理组的罗非鱼肝脏中的AFB1残留量随着时间的延长而明显增加，20周后的残留量为15周的2倍（P0.05）。另外，在采食不同AFB1含量的饲料15或20周后，各组罗非鱼肌肉中并未检出有AFB1残留（1μgAFB1/kg样品）。
3.7肝组织病变
上述数据表明，肝脏可能是AFB1毒性作用的主要靶器官，因此我们进行了肝脏病理组织学检查。与对照组相似，85、μgAFB1/kg处理组的肝脏细胞呈较正常状态（图4A）。、μgAFB1/kg处理组的罗非鱼肝脏细胞中有大量的炎症细胞和嗜酸性颗粒聚集（图4B、4C），并有少量的空泡出现；而最高剂量组（μg/kg组）的肝脏细胞则有严重的空泡化坏死（图4D）。这一现象说明了AFB1污染会引起罗非鱼肝脏结构的变化，且肝脏受损程度与饲料中的AFB1浓度呈正比。
图4采食不同浓度AFB周后的部分罗非鱼肝脏切片显微图
（A为对照组的正常肝细胞；B为μgAFB1/kg组；C为μgAFB1/kg组；D为μgAFB1/kg组）
4讨论
本实验采用自然方式获得黄曲霉毒素而非添加纯品的形式进行罗非鱼致毒实验研究，这与饲料及原料受霉菌污染时的黄曲霉毒素产生以及存在形式更为相似，因而能更好地反映自然存在的黄曲霉毒素对罗非鱼的影响。经过实际检测，饲料中的T-2毒素、玉米烯酮、赭曲霉素、烟曲霉毒素和呕吐毒素都非常低，这说明了花生粕接种黄曲霉菌的过程中并没有过多引入其它霉菌，确保了实验不受其它毒素的联合作用的影响，因而可以较准确反映罗非鱼的AFB1中毒症状。
目前研究罗非鱼的黄曲霉毒素慢性中毒症的实验（Zaki等，8）的染毒周期一般都比较短（一般不超过12周），难以较准确地评估罗非鱼长期采食受霉菌毒素污染的饲料后的机体受损情况以及以其组织被作为人类食物所存在的安全隐患。因而，本实验采用20周的染毒周期，罗非鱼从20g长到约g，增重率超过％，这为评价罗非鱼长期染毒的机体变化情况以及消费这些食物的安全性提供了可靠的数据。实验结果显示，罗非鱼长期暴露在AFB1污染下，其中毒症状的严重程度与饲料中的AFB1含量以及暴露周期的长短有关；这与在黑鲈（El-Sayed等，9）和黑虎虾（Boonyaratpalin等，1）等动物中的研究结果相似。
在本实验中，罗非鱼的AFB1长期慢性致毒的症状表现为体表变黄、厌食、喜静、失重、饲料效率降低、肝脏机能紊乱甚至出现组织学病变，上述现象在Santacroce等（8）综述中也有类似的描述。本实验清晰地揭示了AFB1慢性中毒的严重程度与染毒剂量、暴露的时间呈正相关性。罗非鱼采食含AFB1的饲料后，采食量下降，厌食程度与饲料中的AFB1含量成正相关性。在20周的染毒实验过程中，饲料中含μg/kg或更高剂量的AFB1显著地抑制了罗非鱼的生长，与对照组相比表现为较低的增长率和饲料效率。而最高剂量组的罗非鱼增重最慢、饲料系数最高，且与其它各组差异显著。
这种现象的产生可能是由于黄曲霉毒素导致罗非鱼肝脏发育不良并对其机能产生损害，对营养物质的吸收、利用能力下降，从而使脂肪、糖类等营养物质在体内的沉积减少；并且由于肝脏机能的受损程度与黄曲霉毒素的含量呈正相关关系，增重率和饲料效率的变化也呈现相应的变化。前人的实验中，采食含AFB1饲料的各种实验动物也表现为增重率的下降和饲料系数的升高，如罗非鱼（Zaki等，8）、斑点叉尾鮰（Jantrarotai等，）、虾（Boonyaratpalin等，1）和猪（Meissonnier等，7）等。
20周的实验中，饲喂含不同浓度AFB1（19~μg/kg）的饲料并没引起罗非鱼非正常的死亡，各组存活率的差异不显著。Tuan等（2）报道了尼罗罗非鱼进食高达10mgAFB1/kg的饲料8周后，也没有增加其死亡率。Chávez-Sánchez等（）推算即使饲料中的AFB1高达30mg/kg都不会引起罗非鱼的非正常死亡。本实验也证实了罗非鱼可以耐受较高浓度的食源性AFB1；同时也对Cagauan等（4）关于罗非鱼摄食含53.02~.34μgAFB1/kg的饲料90天后引起67％的死亡率的报道提出质疑。
肝脏是黄曲霉毒素中毒的首要攻击目标。在本实验中，AFB1慢性致毒的罗非鱼肝脏的病变表现为肝脏的发育不良、组织损伤、肝脏解毒酶的活力下降，以及肝脏中积累AFB1。AFB1抑制肝脏的正常发育，数值上表现为肝体比随着饲料中黄曲霉毒素含量的升高而降低，这与Usanno等（5）关于罗非鱼的AFB1染毒实验结果一致。肝体比可反映动物体内储存能量的多少，鱼在恶劣的环境中肝脏储存的能量较低，即肝脏较小。Coimbra等（7）报道，暴露于1mg/kg硫丹21天后的罗非鱼肝体比也明显变小。然而，其它一些动物如小猪，AFB1污染后的肝体比无显著性差异（Meissonnier等，7）。
这可能是由于不同的物种对AFB1染毒有不同的机体反应，罗非鱼受到有害物质污染时表现为肝脏发育不良，甚至萎缩。同时，从肠脂比随着染毒剂量的增加而减少可以看出，罗非鱼采食AFB1饲料后还表现出肠道脂肪减少的症状。这可能是罗非鱼在AFB1中毒后采食量下降，而积累能量物质下降，且动用自身脂肪供能，进而使体内的脂肪储存量进一步下降；也有可能是AFB1影响罗非鱼脂肪酸的合成、转运。实验过程中罗非鱼的脏体比也呈下降趋势，这可能是上述的肝体比、肠脂比下降的综合体现。此外，由鱼体肥满度可知，AFB1对罗非鱼的体型上影响不大。
20周的染毒实验后，、、μgAFB1/kg等剂量组的罗非鱼的肝脏表现为炎症细胞、嗜酸性物质等增多。同时，、μgAFB1/kg饲料组还表现为肝脏水肿、空泡化严重；而且水肿或空泡化的程度与AFB1的剂量呈正相关。上述现象与Usanno等（5）的结果相似，都表明罗非鱼的AFB1中毒症表现为肝脏细胞受损；而Tuan等（2）则认为罗非鱼摄食含2.5mgAFB1/kg的饲料8周后并不会引起肝脏病变。上述实验结论的异同可能由实验周期的长短不同而引起，本实验为期20周可使得AFB1中毒症状有足够的时间体现出来。另外，AFB1还会引起肝脏组成（粗蛋白、粗脂肪以及水分等含量）的改变。经过20周染毒实验以后，AFB1浓度为μg/kg或更高剂量时的罗非鱼肝脏的水分明显多于对照组，而脂肪则低于对照组。因此，我们认为肝脏的水分含量从另一侧面反应了肝脏的水肿和空泡化。
药物代谢酶P的EROD活力被广泛地用作评价有机污染物的生物标记，一般在污染早期P酶被诱导而使得EROD活力升高；但染毒时间延长后，则往往表现为P酶解毒能力的受抑制。本实验中，85、、、、μg/kg的罗非鱼在染毒20周后，EROD活力明显低于对照组。Meissonnier等（7）发现AFB1会降低肝脏解毒酶P酶含量的同时也会抑制其活力；上述作者还认为EROD活力的变化可以作为小猪AFB1中毒后的首要评价标准。罗非鱼肝脏解毒酶PEROD活力的降低可能与长期AFB1染毒造成的肝脏损伤有关。
AFB1在罗非鱼肝脏中的积累更加印证了罗非鱼的AFB1中毒症与剂量、暴露时间长短呈正相关的关系。高剂量组罗非鱼肝脏有着更多的AFB1残留，且延长暴露时间也会使得AFB1残留量有所增加。这是因为肝胆系统被作为AFB1及其代谢物积累和排泄的理想场所（Valsta等，）。然而直到实验结束时罗非鱼肌肉样品没有检出AFB1残留，这与先前的罗非鱼（Usanno等，5）和虾（Bautista等，）等实验结果相似。Chen等（）报道了鸡仔连续采食含μg/kgAFT的日粮35天后，检测出其腿肉中有0.11μg/kg的黄曲霉毒素残留，而在胸肉中则有0.09μg/kg的残留，肝脏中的残留量则达到2.6μg/kg。
在鱼类的研究中也发现，黄曲霉毒素在可食用部分的残留也远低于FDA关于20μg/kg的限量。Wu（）发现，斑点叉尾鮰连续3天采食含有μg/kgAFB1的饲料后就能在其肌肉中检测出2.2~3.8μg/kgAFB1；采食含有0μg/kgAFB1的饲料3天后，肌肉中的AFB1检测值达到7.6~27.6μg/kg（9尾鱼），7天后的检测值为8.9~25.2μg/kg。同时，Wu还发现在禁食以后叉尾鮰肌肉中黄曲霉毒素很快得到降解，禁食3天后的肌肉样品只能检测出0.1μg/kg的AFB1残留值，禁食21天后检测肌肉样品中完全不含AFB1。正如Plakas等（）描述，AFB1与其代谢物在斑点叉尾鮰的组织中被迅速地排出，因而肌肉上的残留微乎其微。由本结果可知，罗非鱼采食含19~μgAFB1/kg饲料长达20周后，其肌肉部分仍然是安全的。但无论如何，在向动物投喂受霉菌污染的饲料或原料时都应该保持警惕。
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